光敏蛋白、光遗传学及其在神经科学中的广泛应用

显示全部楼层 · 2022-3-16 19:01:45

大脑是人最复杂的器官，人们的感觉、记忆、思考、运动等诸多生理和行为活动，以及各种神经系统疾病都与神经元的功能息息相关。平均而言，我们大脑中860亿个神经元中的每一个神经元都与其他神经元形成大约一千个连接；其中所产生的电信号和化学信号可以引发复杂的信息模式，进而驱动感觉、思想、运动和行为等。为了阐明大脑如何正常运行以及神经疾病如何发生，神经科学研究人员需要解析和绘制这种令人惊奇的神经元连接。理解各种神经元的具体功能以及它们是如何连接的一直是神经生物学中最重要的研究方向之一。
几十年来，科学家们一直幻想着能够激发或抑制特定的神经元，进而辨别其正常的功能。神经生物学家们曾经尝试过各种方法，比如，用微电极来刺激神经元，或者使用化学物质来模拟或者拮抗神经递质。然而，这些方法都有难以克服自身的缺陷：微电极控制的精度不够，而不能特异性地控制某一类神经元；而化学物质控制神经元的速度则难以控制，很难在毫秒级别进行操作。一种理想的策略将有助于以局部的和细胞类型特异的精度快速操纵警觉动物的大脑回路。早在1999 年，DNA双螺旋结构的共同发现者弗朗西斯·克里克 (Francis Crick)就推测光可能这方面发挥作用，尽管他当时认为这个想法“相当地不靠谱”。
事实上，特异性地控制神经元活动一直是神经生物学家梦寐以求的技术。如果能特异性地激活某一类神经元，那么就可以通过观察激活后的生理现象来推测其功能；相反，如果能特异性地抑制某一类神经元，则可以推测这类神经元对哪些生理活动是必须的。
紫色的膜与光传感器
1969 年，德国慕尼黑大学化学家迪特·厄斯特黑尔特（Dieter Oesterhelt，1940年-），到美国加州大学旧金山分校电子显微镜专家沃尔瑟·斯托克尼乌斯（Walther Stoeckenius，1921年7月3日-2013年8月12日）教授实验室开展学术休假的合作研究。当时，斯托克尼乌斯正在研究一种可以在高盐环境中生存的古细菌的细胞膜，这种微生物现在被称作盐生盐杆菌（Halobacterium salinurum）。然而，在低盐溶液中，该盐生盐杆菌则分解产生可分离的生化部分，包括紫色的膜部分。

起源于微观，作用于宏观

厄斯特黑尔特注意到，添加特定的溶剂会使颜色褪色；而他对这种化学上的变色现象感到十分困惑。但当一位同事告诉他，青蛙的眼睛在过度照明时会从红色变成黄色，他有了一个奇妙而令人振奋的想法 —— 也许单细胞古细菌中的紫色物质含有视黄酸（retinoic acid），一种基于维生素 A 的化合物，能够与称为视蛋白的蛋白质结合。视黄酸和视蛋白对动物的视力至关重要。随后，厄斯特黑尔特确定了紫色膜中与视黄酸结合唯一的蛋白质，并将其命名为细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）。1971 年，厄斯特黑尔特和斯托克尼乌斯提出了细菌视紫红质起到了光传感器或光感受器的作用。
在后来的继续合作研究中，厄斯特黑尔特发现，细菌视紫红质可以将质子泵出细胞。这个神奇蛋白质，像是一个微型光能发电机，能吸收光子的能量，用这些能量把质子泵到细胞的外面，从而进一步转化为细菌所需的能量。
微生物的光敏蛋白
20世纪80年代，彼得·黑格曼（Peter Hegemann）加入位于慕尼黑的马克思·普朗克生物化学研究所厄斯特黑尔特实验室攻读博士学位。黑格曼的博士论文，研究的是来自另一种含视黄醛的细菌视紫红质 —— 卤化视紫红质（halorhodopsin），并发现卤化视紫红质可以将氯离子输送到细胞中。细菌视紫红质和卤化视紫红质这两种物质的发现以及对其生物物理、结构和遗传学的研究，为光遗传学的发展提供了必要的基础。
卤化视紫红质也存在于一种耐盐古细菌中，其利用光能将其生活的高盐度环境中的氯离子排出体外。黑格曼首先通过生物化学技术分离提纯了这一蛋白。此时，刚刚在法兰克福的马克思·普朗克生物物理研究所建立自己实验室的恩斯特·班贝格（Ernst Bamberg）也参加了该项研究。班贝格通过构建体外系统来研究黑格曼所提纯出的卤化视紫红质的电化学特性。
1984年获得博士学位后，黑格曼来到美国雪城大学的肯·福斯特（Kenneth Foster）的实验室从事博士后研究。福斯特研究的是另一种对光敏感的微生物 —— 单细胞绿藻。这些单细胞莱茵衣藻 （Chlamydomonas reinhardtii）具有趋光性，能够挥舞鞭毛向着有光的方向游去，从而进行必需的光合作用。福斯特认为，单细胞绿藻也可能使用某种视紫红质作为它们的眼睛，从而得知光亮的方向，并且能驱动鞭毛游往有光的地方。
1986年，黑格曼回到普朗克生物化学研究所建立自己的实验室，开始潜心研究莱茵衣藻趋光性行为。1991年，黑格曼发现，莱茵衣藻的光受体也是一种视紫红质，但它的工作方式与之前发现的几种视紫红质都不一样。莱茵衣藻视紫红质在光照之后会引起钙离子流入细胞中，从而引起的电流能够激发鞭毛的运动，他称之为光电流（photocurrent）。
人眼中的视紫红质感光之后也会产生光电流，通过神经传递到大脑之后就形成了视觉。人眼中视紫红质引起光电流需要经过细胞内一系列蛋白的信号传导，而黑格曼发现莱茵衣藻视紫红质产生光电流的速度比人眼中的视紫红质快得多。据此黑格曼大胆地推测：莱茵衣藻视紫红质本身可能就是一个可以作为电流开关的离子通道。然而，此后的十年里，黑格曼使尽各种办法，也无法像当初分离提纯卤化视紫红质一样，分离提纯出莱茵衣藻视紫红质。
随着分子生物的发展，黑格曼和其他科学家于2001年通过DNA测序莱茵衣藻的基因组发现了两个新的光受体基因。为了证明它们究竟是不是苦苦追寻十余年的莱茵衣藻视紫红质，黑格曼找到了当初合作研究卤化视紫红质电化学特性的班贝格。此时的班贝格已经是普朗克生物物理研究所的所长。班贝格和普朗克生物物理研究所的科学家格奥尔格·纳格尔（Georg Nagel）早在1995年就将细菌视紫红质表达在动物细胞中，使得动物细胞在受到光照时产生光电流。
2003年，从黑格曼那里得到光受体基因后，班贝格和纳格尔用同样的方法成功地在动物细胞中表达了莱茵衣藻视紫红质蛋白，从而发现只要有这个蛋白单独存在，就能产生光电流，使阳离子流入细胞中，造成细胞去极化。他们的结果终于证明黑格曼的莱茵衣藻视紫红质是一个能被光所打开的阳离子通道假说。
尽管人们知道，特定的化学分子、电压的变化，或者机械力的变化可以开关特定的离子通道，但是能被光直接控制的离子通道还是第一次被发现。于是他们把莱茵衣藻视紫红质命名为视紫红质通道蛋白1（Channelrhodopsins，ChR1）。他们还在爪蟾的卵细胞中表达了这种蛋白，发现光照可以引起细胞的静息电位发生变化。这项开创性的工作发表在了2002年6月的Science 上。 2003年，纳格尔和黑格曼又发现了一个新的通道蛋白 ——视紫红质通道蛋白2（ChR2）。这一次，他们不但做了更深入的机制研究，而且把ChR2首次在人的细胞（HEK）中表达，并且其论文结论中写道：“ChR2能够成为控制细胞内钙离子浓度或者细胞膜极化水平的有用工具，特别是在哺乳动物细胞中”。
这三种蛋白质的发现和应用催生了光遗传学，促进了光触发离子跨细胞膜的转移。古细菌盐生盐细菌含有细菌视紫红质（bacteriorhodopsin），可将质子泵出细胞，卤化视紫红质（halorhodpsin），可将氯离子泵入细胞。单细胞莱茵衣藻（ Chlamydomonas reinhardtii ）含有视紫红质通道蛋白（Channelrhodopsins，ChR1）；当这些通道打开时，正离子通过膜涌出。特别是ChR1和ChR2的发现，让神经生物学家脑洞大开 —— 这或许就是使用光来控制神经元的理想介质。而光遗传学的大门从这里也正式开启了。

闪烁的洞察力 —— 光遗传学策略

在标准的光遗传学策略中，科学家设计了一个控制区域，在某些细胞类型中打开相邻的视蛋白基因。这种 DNA 被包装成一种良性病毒，然后将其传送到大脑，在大脑中，视蛋白仅在选定的神经元中产生。光纤携带光，激活视蛋白，从而打开或关闭这些特定的神经元，并允许研究人员评估感兴趣的过程和活动。
光遗传学的诞生
视紫红质通道蛋白的发现，不仅仅解释了莱茵衣藻的趋光性行为，纳格尔和班贝格的实验还证明了这个来自莱因衣藻的光敏感通道蛋白能够独自驱使动物细胞产生光电流。因此，借助这个光敏感通道，就可以通过光来遥控动物细胞，特别是神经细胞的电活动。正离子的涌入正是激发神经元信号的原因，使用单个分子引导大脑回路的前景令人激动不已。
用光来改变神经细胞的电活动是神经科学家长久以来的梦想，光刺激有着比传统药物刺激和电刺激更高的时空精确性，并且对组织的伤害更小。20世纪90年代，科学家开始使用光控释放神经递质来激活细胞，但这种方法的时空的精确性仍然不够。
2002年，神经科学家格罗·米森伯克 (Gero Miesenböck）开始在光控中引入遗传学，尝试将果蝇眼中的视紫红质表达在哺乳动物细胞中，或者将哺乳动物的离子通道蛋白表达在果蝇的神经细胞中。使用遗传学的优势在于，可以专门针对研究者想要测试的神经细胞进行遥控，但米森伯克缺乏一种强有力的工具可以让光精确地改变神经活动。
2003年在莱因衣藻中发现的视紫红质通道蛋白正好提供了这样一个强有力的工具。2000年，爱德华·博伊登（Edward S. Boyden，1979-）来到斯坦福大学，在钱永佑（Richard Tsien，钱永健的哥哥）和詹妮弗·雷蒙德（Jennifer Raymond）教授的指导下，攻读博士学位。在钱永佑的实验室，博伊登遇到了钱永佑之前的博士生卡尔·戴瑟罗斯（Karl Deisseroth，1971-）。戴瑟罗斯在斯坦福大学学习过神经生物学，并在斯坦福医院当过精神科住院医师。有着工程背景的博伊登和医学背景的戴瑟罗斯经常在一起讨论当时神经生理学的研究技术。多次的思想碰撞让两位年轻人意识到，当时的技术还有很大局限，神经生物学家需要更好的工具来控制大脑中特异的神经元，他们决定开发这样的工具。
1999年，博伊登阅读了一篇论文，获悉在嗜盐碱单细胞菌中发现的卤化视紫红质（halorhodopsin），能够在大脑的氯离子浓度下工作。这种视紫红质可以在受光照时激活离子通道。他写邮件给这篇论文的作者，索要了这个蛋白的基因。但后来由于博伊登忙于博士学位论文，这件事情被晾在了一边。2003年秋天，戴瑟罗斯获得斯坦福大学独立PI的职位，计划组建自己的实验室。他邀请博伊登博士毕业后可以去他的实验室做博后，一起开展之前讨论的使用磁场控制神经元的项目。
从2003年10月到2004年2月，纳格尔、黑格曼和班贝格及同事们在PNAS期刊上发表了前文提到的ChR2的论文。博伊登阅读这篇论文时立刻意识到，ChR2拥有他们设想过的一切特性：一个蛋白能够把输入信号（光）和输出（去极化神经细胞）偶联起来。
博伊登告诉戴瑟罗斯，希望能联系纳格尔索要ChR2的克隆。戴瑟罗斯于2004年3月联系了纳格尔。那时，纳格尔已对ChR2做了一些改良，他把这些改良后的克隆寄送给了戴瑟罗斯和博伊登。博伊登当时还在钱永佑的实验室做他的博士课题。但从2004年7月开始，博伊登几乎把博士课题放在了一边，专心做起了ChR2在神经元中表达的项目。2004年8月4日的凌晨1点，博伊登在钱永佑的实验室里用蓝光照射表达了ChR2的神经元，成功观察到了去极化和动作电位。
2005年初，张锋来到戴瑟罗斯实验室开始了博士研究生生涯。他改进了博伊登的表达体系，使用慢病毒在神经元中表达ChR2，大大增加了该系统的稳定性。2005年4月19日，博伊登和戴瑟罗斯把他们的发现投稿给 Science 杂志，遭拒稿，理由是没有具体的科学发现。5月5日，他们投稿到 Nature杂志，Nature建议把稿件转投给Nature Neuroscience杂志。经过一轮修改，Nature Neuroscience接受了这篇文章，标志光遗传学技术在科学界发表了。
光照使表达了Channelrhodopsin的神经元放电
光遗传学的发明，几乎在一夜之间改变了神经科学研究。从线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠到灵长类动物，人们在几乎所有实验动物中表达光敏感通道来实现远程遥控神经活动。通过在不同类型的神经细胞中表达光敏感通道，人们可以用光控制小鼠的行为，控制它们的运动，使它们产生虚拟的饥饿感或饱腹感，甚至在它们脑中用光写入或抹去特定的记忆。
打开和关闭活体动物中基因定义的神经元子集已经改变了大脑功能的研究，但给定类型的细胞并不总是一起行动。 2012 年，戴瑟罗斯的团队通过定制视蛋白与双光子技术一起使用，成功地控制了活体小鼠的单个神经元。2019年，研究人员应用该系统来操纵与从社交互动和食物消费中获得的奖励相关的小鼠大脑区域中的单个细胞。例如，他们通过针对某些社会细胞来限制进食。科学家们正在应用光遗传学来区分大量的适应性和非适应性行为。通过使用抑制性和刺激性视蛋白，戴瑟罗斯及其同事阻止口渴的老鼠寻找水，并促使完全水合的动物大口大口地喝水。
光遗传学已经成为神经科学中证明因果性的关键手段。这一技术也为众多医学应用开辟了道路。科学家们希望能利用光，给盲人提供基本视力，刺激患有帕金森病的患者的深部脑，甚至影响心律，以治疗心力衰竭。

用光纤控制实验鼠的行为

作为一项彻底改革了神经科学发展的技术，光遗传学也让包括黑格曼、纳格尔、班贝格、戴瑟罗斯、博伊登在内的科学家在过去几年中屡获殊荣，其中包括了2010年《科学》杂志十年最佳进展，2013年的大脑奖，2015年的生命科学突破奖、2016年度科学突破奖、2019年的拉姆福德奖金、和2020年的邵逸夫奖和2021年拉斯克奖（https://www.toutiao.com/w/a1711836103293956/?log_from=8bbbc1efc771c_1633250807151）等。光遗传学技术能否获得今年的诺奖，我们拭目以待。

迪特·厄斯特黑尔特（Dieter Oesterhelt）

迪特·厄斯特黑尔特发现了一种古细菌蛋白质细菌视紫红质（bacteriorhodopsin），并阐明细菌视紫红质可以在光照条件下将质子泵出细胞。

彼得·黑格曼（Peter Hegemann）

彼得·黑格曼在单细胞藻类中发现了相关的视紫红质通道蛋白（Channelrhodopsins），并揭示了当光照启动这些视紫红质通道时，正离子通过膜涌出。

卡尔·戴瑟罗斯（Karl Deisseroth）

卡尔·戴瑟罗斯利用这些分子创建了光触发系统，并成功用在活的、自由移动的动物身上，以解析在迷宫一般的脑回路中特定类别乃至某一类神经元的功能作用。
三位科学家发现了可以激活或沉默单个脑细胞的光敏微生物蛋白，并将其用于开发光遗传学 —— 掀起了神经科学领域的一场革命。

参考文献：
Oesterhelt, D., and Stoeckenius, W. (1971). Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. Nat. New Biol. 233, 149-152.
Oesterhelt, D., and Stoeckenius, W. (1973). Functions of a new photoreceptor membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70, 2853-2857.
Bamberg, E., Tittor, J., and Oesterhelt, D. (1993). Light-driven proton or chloride pumping by halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 639-643.
Kolbe, M., Besir, H., Essen, L.-O., and Oesterhelt, D. (2000). Structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin at 1.8 Å resolution. Science. 288, 1390-1396.
Nagel, G., Ollig, D., Fuhrmann, M., Kateriya, S., Musti, A.M., Bamberg, E., and Hegemann, P. (2002). Channelrhodopsin-1, a light-gated proton channel in green algae.
Science. 296, 2395-2398.
Nagel, G., Szellas, T., Huhn, W., Kateriya, S., Adeishvili, N., Berthold, P., Ollig, D., Hegemann, P., and Bamberg, E. (2003). Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 13940-13945.
Kato, H.E., Zhang, F., Yizhar, O., Ramakrishnan, C., Nishizawa, T., Hirata, K., Ito, J., Aita, Y., Tsukazaki, T., Hayashi, S., Hegemann, P., Maturana, A.D., Ishitani, R., Deisseroth, K., and Nureki, O. (2012). Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374.
Wietek, J., Wiegert, J.S., Adeishvili, N., Schneider, F., Watanabe, H., Tsunoda, S.P., Vogt, A., Elstner, M., Oertner, T.G., and Hegemann, P. (2014). Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344, 409-412.
Boyden, E.S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., and Deisseroth, K. (2005). Millisecond- timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263- 1268.
Zhang, F., Wang, L.-P., Brauner, M., Liewald, J.F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P.G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., and Deisseroth, K. (2007). Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639.
Aravanis, A.M., Wang, L.-P., Zhang, F., Meltzer, L.A., Mogri, M.Z., Schneider, M.B., and Deisseroth, K. (2007). An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J. Neural. Eng. doi: 10.1088/1741- 2560/4/3/S02
Gradinaru, V. Mogri, M., Thompson, K.R., Henderson, J.M., and Deisseroth, K. (2009). Optical deconstruction of Parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359.
Berndt, A., Lee, S.Y., Wietek, J., Ramakrishnan, C., Steinberg, E.E., Rashid, A.J., Kim, H., Park, S., Santoro, A., Frankland, P.W., Iyer, S.M., Pak, S., Åhrlund-Richter, S., Delp, S.L., Malenka, R.C., Josselyn, S.A., Carlén, M., Hegemann, P., and Deisseroth, K. (2016). Structural foundations of optogenetics: determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 822-829.
Allen, W.E., Chen, M.Z., Pichamoorthy, N., Tien, R.H, Pachitariu, M., Luo, L., and Deisseroth, K. (2019). Thirst regulates motivated behavior through modulation of brainwide neural population dynamics. Science. doi: 10.1126/science.aav3932
Zhang, F. Vierock, J., Yizhar, O., Fenno, L.E., Tsunoda, S., Kianianmomeni, A., Prigge, M., Berndt, A., Cushman, J., Polle, J., Magnuson, J., Hegemann, P., and Deisseroth, K. (2011). The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457.
Grote, M., Engelhard, M., and Hegemann, P. (2014). Of ion pumps, sensors and channels–Perspectives on microbial rhodopsins between science and history. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 533-545.
Deisseroth, K., and Hegemann, P. (2017). The form and function of channelrhodopsin. Science. 357. doi: 10.1126/science.aan5544
Fenno, L., Yizhar, O., and Deisseroth, K. (2011). The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412.
Deisseroth, K. (2015). Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nat. Neurosci. 18, 1213-1225.

光敏蛋白、光遗传学及其在神经科学中的广泛应用

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